NuHi Robustic SYBR Green 预混液

产品介绍

本制品是采用SYBR Green染料法进行Real Time PCR的专用试剂。

本制品包含：经化学修饰的Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、经优化后的缓冲液等扩增必需组分(模板、探针与引物除外)。制品中的DNA聚合酶是经化学修饰的Hot Start法DNA聚合酶，与精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制体系中非特异性PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。

产品特点

激活时间短：激活时间降至5min，PCR净时间65 min

特异性强：有效抑制引物二聚体

灵敏度高：低至6拷贝均可扩增

通用性强：300bp长度片段，65%GC含量均可高效扩增

信号更高：更高性噪比，扩增曲线更美观

稳定性强：放置8天Ct及特异性无变化

规格

2×，5ml/瓶，50ml/瓶，500ml/瓶

储存条件

在使用前推荐-20℃保存，在使用后推荐4℃避光保存，避免反复冻融。

适用仪器

NuHi^® Robustic SYBR Green Mix中含有特殊的ROX参比染料，适用于所有荧光定量PCR仪。

推荐反应程序

*1激活时间为2min。延长激活时间时，扩增特异性会降低。

*2在扩增高GC含量片段时，可适当增加变性时间至15-30秒。

*3退火延伸时间，可根据所扩增片段长度及荧光定量PCR仪器做适当调整。扩增片段长度300bp以内，推荐退火延伸时间25秒。

*4溶解曲线分析程序，可根据不同机器或需要进行调整。

Q-1. 反应无扩增曲线
a) 确认阳性对照有无扩增：每次实验推荐附带检测试剂，引物/探针及模板性能的阳性对照
b) 反应循环数不够：一般设置循环数为40-50
c) 信号采集未设置：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在延伸阶段
d) 引物/探针降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除降解的可能性
e) 模板存在抑制性：所获得模板中是否存在纯化不彻底情形需排除
f) 模板浓度太低：减少稀释度重复试验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起
g) 模板降解：重新制备模板，重复试验
h) 操作失误或设备故障：需排除
i) 未按照说明书条件进行实验：在一般情况下优选说明书所提供反应条件

Q-2. 扩增曲线不正常

a) 扩增曲线不光滑：信号太弱或扩增效果过低，需提高模板浓度重复
b) 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度过高，减小基线终点重新分析数据或对模板进行稀释重新检测
c) 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，扩增反应前仔细检查反应管内是否有气泡残留并通过离心方法去除
d) 模板存在抑制性：所获得模板中存在扩增抑制剂，可能导致曲线异常

Q-3. Ct值过大

a) 扩增效率低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物或探针
b) 模板浓度低：减少稀释度重复试验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起
c) 模板降解：重新制备模板，重复试验
d) 模板存在抑制性：所获得模板中存在扩增抑制剂，可能导致扩增失败，提高模板稀释倍数或者重新制备模板
e) PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内
f) 反应条件不适合：优化退火温度及延伸时间

Q-4. SNP分型点分布不理想

a) 扩增效率低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物探针
b) 模板浓度低：减少稀释度重复试验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起
c) 模板降解：重新制备模板，重复试验
d) 模板存在抑制性：所获得模板中存在扩增抑制剂，可能导致扩增较差，信号较低，提高模板稀释倍
e) 探针设计不理想：探针识别能力有限，建议重新设计探针

Q-5. 阴性对照NTC有扩增

a) 反应试剂被污染：更换新批次试剂并在有条件情况下更换实验场地重复试验
b) SG Mix中可能出现引物二聚体扩增：查看溶解曲线并与目的产物溶解曲线对比，如若为二聚体产物且Ct>36可忽略

Q-6. 标准曲线线性关系不理想

a) 加样误差：加大模板稀释倍数，提高加样体积，减少加样误差
b) 标准品稀释不准确：重新稀释标准品并重复实验
c) 扩增效率差：引物扩增效率较差，可优化反应条件或重新设计引物
d) 标准品降解：重新制备标准品，重复试验
e) 标准品使用浓度过高：适当降低标准品使用浓度，重复实验

Q-7. SG溶解曲线多峰

a) 引物设计非特异：根据设计原则设计新的引物
b) 反应条件不适合：优化退火温度，增加反应特异性
c) 引物浓度太高：适当降低引物浓度
d) 模板浓度低：减少稀释度重复试验，高浓度模板下会使特异性变强

Q-8. 实验重复性差

a) 仪器状态不佳：定期校准仪器
b) PCR板材或贴膜均一性差：更换优质供应商
c) 模板浓度低：减少稀释度重复试验，高浓度模板下会使扩增重复性加强
d) 加样体积存在较大偏差：使用电动连续分液器并仔细操作，同时增大试剂操作体积
e) 试剂混匀不佳：混合试剂要充分混匀并离心后使用

Q-9. 产品稳定性如何

a) 产品-20℃保存有效期1年，4℃保存有效期1个月
b) 反复冻融次数不得超过8次

产品说明书

引物及探针浓度测定

样品浓度计算表